عملية تخمير واستخلاص البنسلين أسيلاز

أو. البنسلين أسيلاز وخصائصه

البنسلين أسيلاز ، المعروف أيضا باسم البنسلين أسيلاز أمينوهيدرولاز ، أو البنسلين أسيلاز أمينوهيدرولاز. يتم الحصول عليها بشكل أساسي من إنزيمات داخل الخلايا من الإشريشيا القولونية ، والإنزيمات خارج الخلية من عصية megaceus ، والإنزيمات داخل الخلايا من Pichia pastoris. وقد تم استخدامه على نطاق واسع في إنتاج المواد الوسيطة الهامة للمضادات الحيوية بيتا لاتام والمضادات الحيوية شبه الاصطناعية بيتا لاتام. البنسلين أسيلاز هو إنزيم يحفز تفاعلات البنسلين على وجه التحديد. يستخدم البنسلين أسيلاز بشكل رئيسي في عملية إنتاج حمض 6-أمينو (6-أبا). يتم الحصول على 6-أبا أساسا عن طريق deacylating البنسلين G من خلال البنسلين أسيلاز. بالإضافة إلى ذلك ، بسبب الخصائص المضادة للبكتيريا ، والمضادة للحساسية للبنسلين أسيلاز ، من الصعب أن تتحلل بواسطة الإنزيمات في الخلايا الجرثومية ؛ بالإضافة إلى ذلك ، بسبب سهولة تكوين بقايا مضاد حيوي من البنيسيلين أسيلاز ومشكلة السرطنة ، لطالما كانت معالجة هذه المواد والتحكم فيها مشكلة صعبة في مجال أبحاث المضادات الحيوية.

أو. ما هو acylation ؟

وتسمى أيضا Acylation acylation. تشير الأسيلة إلى تفاعل إدخال ذرات الأسيفاتية acyl RCO-أو ArCO acyl العطرية-إلى النيتروجين أو الأكسجين أو الكربون أو الكبريت في الجزيئات العضوية. المنتجات بعد الأسيلاتيون هي مركبات مثل الكيتونات (الألدهيدات) ، الأميدات والاسترات. يمكن تقسيم تفاعلات الأسيلايشن إلى أكسجين ، أسيل النيتروجين وأكلة الكربون وفقًا لموقع مقدمة الأسيل. عوامل الاسيلاتيون هي عموما الأحماض الكربوكسيلية أو مشتقات حمض الكربوكسيلية. يمكن أيضًا تصنيف تفاعلات الأسيلاتيون وفقًا لنوع عوامل الأسيلاتينغ.

2 طريقة استخراج البنسلين الأسيلاز

كيفية إعادة تدوير وتنقية البنسلين الأسيلاز ، وخاصة باستخدام Escherichia coli أو Pichia pastoris للهندسة الوراثية. هذا رابط مهم للغاية ، وهذه الخطوة لها تأثير كبير على جودة البنسلين أسيلاز.

أو. تعطيل بالموجات فوق الصوتية. كروماتوغرافي

الاضطراب بالموجات فوق الصوتية ، كروماتوجرافيا وتنقية الاستخراج هي تقنيات شائعة الاستخدام البيولوجية التي يمكن استخدامها لفصل وتنقية واستخلاص الجزيئات الحيوية مثل البروتينات والأحماض النووية. عادة ما يتم تنفيذ العملية بأكملها عند درجة حرارة منخفضة (0 ~ 4 ℃) لتجنب تدهور العينات وتلف. في هذه الدراسة ، تم استخدام Escherichia coli كالبكتيريا المهندسة وراثياً الرئيسية لاستخراج سائل الإنزيم الخام. إزالة جدار الخلية والحمض النووي وأجزاء الدهون في المستخلص يمكن أن يجعل البروتين المستهدف أكثر نقاء وأكثر استقرارًا. من أجل الحصول على نتائج أفضل ، اعتمدت الدراسة مجموعة متنوعة من أساليب التنقية الفعالة مثل طريقة الترسيب المجزأة لكبريتات الأمونيوم ، وطريقة العمود الكروماتوغرافي ، وطريقة هندسة تصميم الألياف الغذائية-52 عمود كروماتوغرافي ، كروماتوغرافيا جل عمود هلام ، إلخ. أظهرت الدراسات أن النشاط المحدد لمحلول الإنزيم الخام من Escherichia coli ضعيف ، وعموما ، هناك حاجة إلى أربع إلى خمس مراحل للتنقية للحصول على نشاط محدد أعلى. يمكن استخدام تكنولوجيا تنقية التكسير بالموجات فوق الصوتية والتصوير اللوني والاستخلاص بفعالية لتنقية محلول الإنزيم الخام من Escherichia coli ، مما يوفر أساسًا موثوقًا للبحث والتطبيق الوظيفي اللاحق.

أو. تأثير الضغط التناضري

تستخدم تقنية النبض عالي الضغط على نطاق واسع في استخراج وتنقية الجزيئات الحيوية. البنسلين أسيلاز هو بروتين داخل الخلايا موزع بشكل رئيسي على غشاء الخلية وجدار الخلية ، وغالبا ما يستخدم في إعداد المضادات الحيوية. في هذه الدراسة ، تم استخراج البنسلين أسيلاز بواسطة تقنية نبض الضغط العالي ، وكان محلول الإنزيم الخام الذي تم الحصول عليه أعلى نشاطًا. من خلال الترسيب بمحلول مائي من كبريتات الأمونيوم ، يمكن الحصول على معدل تفاعل أعلى في وقت واحد ، ويمكن تطبيقه مباشرة على الشلل. من أجل استخراج البنسلين أسيلاز بفعالية ، استخدمت الدراسة طريقة صدمة الضغط التناضحي ، وهي طريقة استخراج بسيطة وسهلة لا تتطلب الكثير من الأدوات ولديها مجموعة واسعة من التطبيقات. هذه الطريقة تفك الإشريشيا القولونية في محلول مفرط التوتر ثم تنقله إلى وسط هيبوتونيك. من خلال عمل الضغط التناضري ، يتمزق جدار الخلية ويخرج الإنزيم من الجسم. هذه الطريقة يمكن أن تمنع مشكلة الإفراج المفرط عن المواد الواردة بسبب تمزق كامل ، والحفاظ بشكل فعال على معدل بقاء البكتيريا. بعد الحصول على الإنزيم الخام ، يمكن تنقيته بطرق مثل ترسيب كبريتات الأمونيوم وتحليل كروماتوغرافي للعمود للحصول على إنزيم كهربية من جل بولي أكريلاميد بهيكل شريط واحد. هذا هو بالضبط بسببطريقة تأثير الضغط التناضحي التي يتم الحفاظ على سلامة جدار الخلية ومعدل بقاء البكتيريا أثناء عملية الاستخراج ، وبالتالي الحصول على محلول إنزيم خام مع نشاط محدد أعلى. بالإضافة إلى ذلك ، تساعد طريقة الاستخلاص هذه أيضًا على الاحتفاظ بهيكل شريط الإنزيم ، مما يساعد على الحصول على نشاط عالي النقاء ، عالي الجودة البنسلين الأسيلاز.

أو. علاج مكثف

البنسلين أسيلاز هو إنزيم مهم وله قيمة تطبيق مهمة في إعداد المضادات الحيوية. في هذه الدراسة ، من أجل فصل البنسلين أسيلاز عن مرق التخمير ، تم استخدام طريقة الامتزاز للفصل. باستخدام هيدروكسيد الأمونيوم لعلاج الأرض دياتومي يمكن استخراج البنسلين أسيلاز مباشرة ، وتعمل في درجة حرارة الغرفة ، مع إنتاجية نشاط إنزيم عالية وآفاق تطبيق صناعي جيدة. بالنسبة لجمع البكتيريا ، يكون استهلاك الطاقة لطريقة الفصل بالطرد المركزي مرتفعًا بسبب صغر حجم الكائنات الدقيقة وصعوبة هطول الأمطار. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن لطريقة التلبد المفردة جمع البكتيريا بالكامل. لذلك ، يمكن استخدام مزيج من flocculants وتكنولوجيا الطرد المركزي لجمع البكتيريا لتحسين كفاءة التجميع وتقليل استهلاك الطاقة بالطرد المركزي. هناك العديد من العوامل التي تؤثر على نشاط الإنزيم أثناء إنتاج واستخلاص البنسلين أسيلاز ، مثل نوع المذيبات وتركيزها ودرجة حرارتها وما إلى ذلك. طريقة ضبط الجرعة وقيمة الرقم الهيدروجيني للإنزيم المستخرج أمر بالغ الأهمية أيضًا. عادة ، يمكن معالجة مرق التخمير مسبقًا لزيادة نشاط الإنزيم ، ثم يضاف الامتزاز ويفصل البنسلين أسيلاز. هذه الطريقة يمكن أن تجعل إنتاج وفصل البنسلين أسيلاز أكثر كفاءة واستقرارًا.

3 عملية تخمير البنسلين الأسيلاز

أو. إعداد الجراثيم

بالنسبة للسلالات المحسنة من التربة الرملية ، يمكن إجراء التحسين الوراثي باستخدام وسائط زراعة تحتوي على الجلسرين والجلوكوز والبروتين وما إلى ذلك. في ظل ظروف درجة حرارة النمو المثلى من 25-26 ℃ و 6-8 أيام ، يمكن الحصول على مستعمرات واحدة ويمكن تنفيذ انتشار المائل ، ويمكن الحصول على الجراثيم المائلة بعد 7 أيام. يمكن زرع هذه الجراثيم في حبوب عالية الجودة أو وسط زراعة صلب للأرز ، وتحتاج ثقافة سلالة الدخن مع 3 مراحل من النمو لمدة 7 أيام عند 25 درجة مئوية إلى إضافة المزيد من مصدر الكربون ومصدر النيتروجين العضوي للحصول على كمية كبيرة من الدخن. بالنسبة للجراثيم التي يتم إنتاجها أثناء عملية التخمير ، يجب إجراء تجارب على قارورة الاهتزاز للتحقق من فعالية وحالة البكتيريا الأجنبية. بالإضافة إلى ذلك ، أثناء عملية زراعة خزانات البذور وخزانات التخمير ، يجب الحصول على كمية كبيرة من الهيفاي بإضافة مصدر الكربون ومصدر النيتروجين العضوي. عملية التخمير لإنتاج البنسلين أثناء تخمير البنسلين أسيلاز ، مطلوب محتوى أكسجين ذائب عالي ومعدل تهوية ، ومعدل تدفق الهواء عادة ما يكون يجب أن تكون سرعة التقليب معتدلة ، بشكل عام ، ~ 200r/min. في المرحلة المبكرة من التخمير ، تكون قوة التحريك كبيرة ، والتي يمكن أن تعزز نمو البكتيريا. بالإضافة إلى ذلك ، يحتاج التحكم في المعلمات مثل الوقت ودرجة الحرارة في كل مرحلة من مراحل التخمير أيضًا إلى التعديل وفقًا لمختلف السلالات وظروف التخمير. خزان التخمير هو الرابط الرئيسي في إنتاج البنسلين أسيلاز على نطاق واسع. في خزان التخمير ، مجموعة متنوعة من المواد ، مثل مسحوق كعكة الفول السوداني ، ومسحوق النخالة ، وشراب الذرة ، والجلوكوز ، واليوريا ، وما إلى ذلك ، يمكن إضافتها لتحسين الحالة الغذائية ومعدل نمو البكتيريا. عند التلقيح ، يُنصح بالتحكم في كمية تلقيح الميسيليوم بين ، من أجل تجنب الهدر وتقليل التكاليف. بالإضافة إلى ذلك ، عند التعامل مع سائل النفايات المتولد أثناء عملية التخمير ، يجب الانتباه إلى حماية البيئة. قد يحتوي سائل النفايات على مجموعة متنوعة من المواد الضارة والملوثات ، والتي تحتاج إلى معالجتها وتفريغها بدقة.

أو. التحكم في تخمير البنسلين أسيلاز

عملية إعداد البنسلين أسيلاز التي تم الحصول عليها البنسلين أسيلاز تحت وسط زراعة مناسب ، ودرجة الحرارة ، والتهوية ، وظروف زراعة التقليب. قبل التخمير ، يتم تطهير المعدات والوسائط ذات الصلة (بشكل رئيسي مصدر الكربون ومصدر النيتروجين والسلائف والأملاح غير العضوية) ، ثم يتم توصيل سائل البذور. خلال هذه الفترة ، من أجل الحفاظ على درجة حرارة وضغط معينين ، غالبًا ما تتم إضافة مزيل الصقيع. إذا تم التحكم في قيمة الرقم الهيدروجيني لسائل التخمير بواسطة الحمض والقلويات ، يجب إضافة أملاح الجلوكوز والأمونيوم بشكل متقطع أو مستمر لتكملة مصدر الكربون ومصدر النيتروجين ، أو يجب إضافة سلائف سائلة أخرى لزيادةمحصول البنسلين أسيلاز.

أو. خصائص عملية تخمير البنسلين أسيلاز

في عملية إنتاج البنسلين أسيلاز ، يعد محلول السكر أحد العناصر الغذائية الرئيسية ، ويمكن أن يؤثر محتوى محلول السكر بشكل مباشر على إنتاج وإنتاجية البنسلين أسيلاز. إذا كان معدل إضافة السكر منخفضًا جدًا ، سينخفض معدل نمو الميسيليوم ، مما يؤثر على نشاط البكتيريا وإنتاجها ، في حين أن نسبة السكر العالية ستؤدي إلى زيادة لزوجة سائل التخمير ، وزيادة عدد الميسيليوم ، وانخفاض الأكسجين المذاب بسرعة ، يؤثر على التقدم الطبيعي للتخمير. لذلك ، من أجل إنتاج البنسلين الأسيلاز الفعال ، يجب التحكم بدقة في محتوى محلول السكر. في الوقت الحالي ، يتم استخدام منحنى معين لمحتوى السكر عادة ، والذي يعتمد على البيانات التجريبية وتم تحسينه وتحسينه. ومع ذلك ، نظرًا لأن المواد الخام لكل دفعة من الإنتاج مختلفة ، تختلف الخصائص المتنوعة لكل دفعة بسبب البلازما الجرثومية المختلفة ، إذا تم استخدام منحنى محتوى السكر نفسه فقط للإضافة ، بعض المنتجات سيكون لها إنتاجية غير كافية. لذلك ، فإن كيفية ضبط محتوى السكر بدقة وفقًا لحالة التمثيل الغذائي للميسيليوم هي أحد مفاتيح التحكم في عملية إنتاج البنسلين أسيلاز. يمكن استخدام منحنيات مختلفة لمحتوى السكر للتعديل وفقًا لحالة التمثيل الغذائي للميسيليوم. عندما يكون عدد الميسيليوم صغيرًا في المرحلة المبكرة من التخمير ، يمكن زيادة معدل إضافة السكر في محلول السكر تدريجيًا لتسريع معدل نمو الميسيليوم. في الوقت نفسه ، في المراحل المتوسطة والمتأخرة من التخمير ، يجب التحكم في محتوى محلول السكر لتجنب تراكم السكر الزائد الذي يؤثر على التمثيل الغذائي الطبيعي لسائل التخمير. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تعديل منحنى محتوى السكر بشكل ديناميكي وفقًا لمحتوى محلول السكر المكتشف في الوقت الفعلي ، وذلك للتحكم بشكل أكثر دقة في محتوى محلول السكر.

4 عملية استخراج البنسلين الأسيلاز

أو. المعالجة المسبقة

بعد اكتمال التخمير ، يتواجد في مرق تخمير Monascus في شكل كثافة بحد أدنى 10 ~ 30 ~ m3 ، يحتوي على كمية كبيرة من الأيونات غير العضوية ذات المحتوى العالي من الأكسجين (Ca ، Mg ، Fe) ، الفطريات ، وسط زراعة غير مستخدم ، خلايا ملوثة بسهولة ، مستقلبات مسببات الأمراض ، البروتينات ، الغرض الرئيسي منه هو إثراء المنتج المستهدف وإزالة كمية كبيرة من الشوائب لمزيد من الفصل والتنقية.

أو. تصفية

مرق التخمير يحتاج إلى المعالجة قبل الاستخراج. يمكن إضافة كمية صغيرة من الندف (مثل الشب) إلى مرق التخمير ، أو يمكن تعديل قيمة الرقم الهيدروجيني لمرق التخمير إلى النقطة متساوي الكهرباء للبروتين لترسيب البروتين ، ثم يتم ضخ السائل العائم في كل غرفة ترشيح محكمة الغلق للمرشح من خلال أسطوانة فراغية (باستخدام الضغط السلبي كقوة الترشيح) أو خرطوشة فلتر مسطحة. تحت ضغط العمل ، يتم الفصل بين السوائل الصلبة من خلال غشاء مرشح أو كعك مرشح آخر. بما أن البنسلين أسيلاز يتحلل بسهولة عند درجة حرارة الغرفة ، فإن درجة حرارة مرق التخمير والمرق أقل من 10 درجات مئوية ، ويكون محصوله أعلى من الترشيح.

أو. استخراج

تم عزل البنسلين أسيلاز من البنسلين أسيلاز عن طريق الاستخلاص بالمذيبات. إنها طريقة لتركيز وتنقية المضادات الحيوية من مرحلة سائلة واحدة (e. ز. ترشيح التخمير) إلى مرحلة سائلة أخرى (e. ز. مذيب عضوي) في ظروف مختلفة من درجة الحموضة ، في حالات كيميائية مختلفة (حمض أو أملاح حرة) ، في مذيبات غير قابلة للذوبان في الماء. بما أن هناك مجموعة كربوكسيل في بنية جزيئات أسيلاز البنسلين و pKa الخاص بها ، يتشكل الحمض الحر عندما يحمض محلول مائي إلى قيمة pH تبلغ حوالي. يحتوي حمض أسيلاز البنسلين على قابلية ذوبان منخفضة للغاية وخواص استخلاص جيدة للمذيبات في الكحول والكيتونات والإثيرات والإسترات وما إلى ذلك ، بحيث يمكن فصلها وتنقيتها من مرق التخمير.

يتم نقل أسيلاز البنسلين إلى مذيب عضوي تحت بيئة حمضية ، ويتم ضبط قيمة الرقم الهيدروجيني إلى حوالي 50 ، ثم تدخل مرحلة مائية محايدة ، ويتم استخراجها عدة مرات ، ثم يتم تنقيتها في النهاية. يستخدم البنسلين أسيلاز مع معامل تقسيم أعلى بشكل عام. يستخدم أسيتات البوتيل وأسيتات n-pentyl بشكل رئيسي في الإنتاج الصناعي. ودرجة الحموضة في أسيتات البوتيل المستخرجة من مرق التخمير هي ، ~ ، وقيمة الرقم الهيدروجيني لأسيتات البوتيل المستخرج من المرحلة المائية هي: ~ تبين النتائج التجريبية أن نسبة تخمير محلول أسيتات البوتيل من الترشيح هي ~ ، من حلول عازلة الكبريتات والكربونات هي لناإد لاستخراج الظهر لمنع تقلبات الحموضة. نسبة مرق التخمير إلى المحلول هي 3 ~ 4. بعد عمليات استخراج متعددة و 10 تركيزات ، يلبي تركيزه شروط التبلور ويصل إجمالي محصول الاستخراج أساسًا. النخل الذي تم الحصول عليه هو في الغالب استخراج ثانوي ، باستخدام محلول حمض الكبريتيك مع الرقم الهيدروجيني من ~ خلات ، ثم يضاف البوتيل ، كمية محلول النخل تقريبًا ، وعادة ما يتم استخراج الجزء الخلفي باستخدام محلول مائي من بيكربونات الصوديوم مع درجة الحموضة ~ أثناء عملية الاستخراج الأولية ، بسبب تركيز البروتين العالي في الترشيح ، يجب إضافة مُزيل النطاف. الخطوة الأولى هي الاستخراج ، يحتوي على البروتين ، وإضافة PPB ~ ،

أو. استخراج

من أجل الحد من تدهور البنسلين أسيلاز ، يجب أن يتم ذلك عند درجة حرارة منخفضة أقل من 10 ℃. يتم تجميد المحاليل الملحية في خزان الاستخراج. أثناء الاستخراج ودرجة الحرارة والحموضة لها تأثير كبير على تدهور البنسلين أسيلاز ، وهو عامل مهم يؤثر على تدهوره. العديد من العلماء الكثير من البحوث على ذلك ، وأجرت مناقشة مفصلة حول تأثير درجة حرارة مياه الصرف الصحي والرطوبة من قيم الحموضة المختلفة على تدهور نصف العمر. تبين النتائج أن مدى ثبات البنسلين هو الأسيلاز بتركيز الهيدروجين ~ ، وأنه يظهر ثباتًا قويًا في pH ، ويمكن أن يتحلل بسرعة في كل من الظروف الحمضية والقلوية. من خلال تركيب المنحنى ، يتم الحصول على العلاقة بين فترة نصف العمر المتدهورة للبنسلين أسيلاز عند درجات حرارة مختلفة وقيمة الرقم الهيدروجيني.

أو. التبلور

يضاف الكربون المنشط إلى المستخلص لإزالة الأصباغ ، ومصادر الحرارة ، والتصفية ، وإزالة الكربون المنشط. عادة ما يتم تكرير المستخلص عن طريق التبلور. في أسيتات البوتيل ، نظرًا لأن ذوبان البنسلين أسيلاز ملح البوتاسيوم منخفض جدًا ، سيتبلور ملح البوتاسيوم أسيلاز البنسلين بعد إضافة أسيلاز البوتاسيوم-إيثانول. على هذا الأساس ، يذوب البوتاسيوم في محلول مائي KOH من خلال طريقة إعادة التبلور ، ويتم ضبط قيمة pH إلى محايد ، ويضاف البوتانول ، وفي النهاية يتم الحصول على المنتج النقي من خلال التقطير الأزيوتروبي. (1) طريقة التبلور المباشر: يتفاعل خلاصة أسيتات البوتيل مع أسيتات الصوديوم-الإيثانول للحصول على ملح الصوديوم البلوري. يتم الحصول على ملح البوتاسيوم أسيلاز البنسلين عن طريق خلط أسيتات البوتاسيوم-إيثانول-أسيتات البوتاسيوم. (2) طريقة التقطير الآزوتروبيك: بعد الاستخراج ، يتم استخراجها باستخدام هيدروكسيد الصوديوم في المول/لتر ويتم ضبط قيمة pH إلى ~ ~ ~ ~ من أجل الحصول على محلول ملحي فيزيولوجي يحتوي على الصوديوم. في 16 ~ 26 ℃ و ، تتم إضافة بــ ~ ~ kPa ، أوقات البوتانول. الماء و n-بيوتانول يتبخر بشكل أزيوتروبيكياً. بلورات أيون الصوديوم عجلت. يتم غسل البلورات وتجفيفها للحصول على منتجات البنسلين أسيلاز.